Là một thành viên của Shinsengumi, Saito được coi là một người thâm trầm và bí ẩn; lời mô tả thường được dành cho anh là "không phải một người có thể bắt đầu những cuộc nói chuyện vãn". Vị trí của anh trong đội Shinsengumi ban đầu là Trợ thủ phó cục trưởng (Fukuchou Jokin). Nhiệm vụ của anh còn bao gồm việc dạy kiếm thuật cho các đội viên (cùng với Okita Sōji). Do có mối quan hệ trước đó với phiên Aizu, Saito bị nghi ngờ đóng vai trò nội gián ở Shinsengumi; nhưng đây vẫn là một câu hỏi, bởi khi được chỉ thị đi theo Ito Kashitarō tách khỏi nhóm Shinsengumi năm 1867, Saito đã làm gián điệp cho chính nhóm. Sự việc này đã bị nghi ngờ bởi Abe Juro, người không bao giờ tin rằng Saito là một nội gián mà cho rằng ông trở lại với Shinsengumi chỉ vì đã nhận hối lộ của một số thành viên trong nhóm của Itou và bị phát hiện.

Trở lại Shinsengumi sau cuộc mưu sát Ito, Saito đã góp phần tiêu diệt nhóm Kodaiji năm 1867 với tên Yamaguchi Jirou. Ngoài ra, cũng có thể Saito còn là gián điệp thu thập tin tức tình báo của cả những đối thủ khác. Người ta còn cho rằng Saito có tham gia vào việc trừng phạt những đội viên biến chất trong Shinsengumi và đóng một vai trò quan trọng trong cái chết Takeda Kanryūsai và Tani Mijuro.

Trong cuộc cải tổ cơ cấu năm 1864, anh được bổ nhiệm làm đội trưởng đội 4 (trước sự kiện "quán trọ Ikedaya" và nhóm Shinsengumi còn mang tính chất một lực lượng quân đội). Tới tháng 4 năm 1865, anh được bổ nhiệm lại làm đội trưởng đội 3 (Shinsengumi đã được công nhận là lực lượng cảnh sát bảo vệ Kyoto). Saito được coi là người có khả năng kiếm thuật ngang hàng đội trưởng đội 1 Okita Sōji và đội trưởng đội 2 Nagakura Shinpachi. Thanh kiếm ưa thích của anh là "Sesshuujuu Ikeda Kishin Ikimaru". Chiêu thức mạnh nhất của Saito là đòn chém vào cánh tay của đối phương, có tính sát thương còn mạnh hơn cả chiêu "Tam đoạn thích" của Okita Sōji. Cùng với những người còn lại của Shinsengumi, anh được ban tặng tước hiệu hatamoto năm 1867.

Trong cuộc chiến Boshin (1868-1869), do vết thương của Hijikata Toshizō, Saito trở thành Cục trưởng Shinsengumi ở phiên Aizu vào ngày 26 tháng 5 năm 1868 (lúc này Saito đã đổi tên thành Yamaguchi Jiro). Khi Hijikata quyết định rút quân khỏi Aizu, Saito đã tách khỏi Hijikata và tiếp tục chiến đấu với quân đội Aizu cho tới cuối cuộc chiến. Sự chia cắt này đã được ghi lại trong nhật ký của Taniguchi Shirobe với việc Ootori Keisuke được Hijikata yêu cầu thay thế trở thành Cục trưởng Shinsengumi. Tuy nhiên; sự kiện này không được khẳng định chắc chắn vì không hề có lệnh rút quân khỏi Aizu về Sendai. Saito cùng với 10 đội viên ở lại đã chiến đấu ngoan cường ở Phật Đường, hoàn toàn bị áp đảo về quân số. Ở đó, Saito Hajime (hay Yamaguchi Jirou) đã nghĩ rằng mình sẽ bị giết; nhưng anh đã trở lại phiên Aizu và gia nhập vào Đội Phượng Hoàng. Sau khi lâu đài Aizuwakamatsu thất thủ, Saito bị bắt tới vùng Tây Nam tại phiên Takada, Echigo nơi anh bị giam cầm như một tù nhân chiến tranh. Sự kiện này đã được Ichinose Denpachi ghi lại.